Kontrola kvality barvení krevních nátěrů metodou May-Grünwald-Giemsa

Kontrola kvality barvení krevních nátěrů
metodou May-Grünwald-Giemsa

Zpracovaly: L. Bourková, M. Matýšková

Text pro?el připomínkovým ?ízením v laboratorní sekci a byl schválen na sch?zi výboru české hematologické společnosti dne 02.11.2005

Hodnocení krevních nátěrů je nejroz?í?en?j?í morfologické vyšetření. Slou?í k vyhledávání, diagnostice a monitorování řady onemocnění.

I na toto vyšetření se vztahují podmínky pro minimální požadavky na kontrolu kvality. Dodr?ováním vlastních standardních operažních postupů a následujících doporučených bod? lze potom v nabarvených nátěrech předejít vzniku ?etných artefakt?.

Preventivní zásady pro správné barvení:

Správné a dostateľné zaschnutí nátěru
Zamezení vlhkostí v roztocích a na nátěru (již 1% příměs vody v metanolu může znemožnit správnou interpretaci vyšetření, zvlá?t? morfologie erytrocytů)
Správné provedení nátěru
P?í manuálním barvení je nutné pracovat v uzav?ených kyvetách (ne na m?í?ce): předchází se tím vypažování metanolu (pozor také na toxické výpary) a vysrážeí barev na sklí?kách.
Při práci s barvícími automaty je třeba s ostatními zásadami také dodržovat i pokyny výrobce.
Včasná fixace: nejlépe barvit nátěry ihned po zaschnutí
-pokud toto není možné, potom je vhodné nátěry nejpozději do 4 hodin po nat?ení a zaschnutí fixovat metanolem (optimální je provést fixaci do jedné hodiny od zhotovení nátěru) - fixované nátěry je možné skladovat po neomezenou dobu.
Použití ?erstv? našed?ných barvících roztokŕ.
Použitelnost roztoku je dána po?tem nabarvených skel, ale roztok nemá být poučíván déle jak 24 hodin. Barví-li se v průběhu dne větší počet skel, doporučuje se připravit čerstvé roztoky i dvakrát za den.

Před barvením nátěru je třeba kontrolovat:

kvalitu skel (nepoužívat poškozená, zažpin?ná, zamažt?ná skla apod.), délku, ?í?ku a sílu nátěru
dodržování doby exspirace všech reagencií (pozor na případně vysrážeé barvící roztoky),
skladování reagencií - vedle spln?ní požadavkŕ výrobce je vhodné
barvící roztoky uchovávat ve tm?
-při skladování diagnostik dodržovat předepsanou teplotu - změna teploty může způsobit vysrážeí barvících roztokŕ:
-barvící roztoky nesmí zmrznout, proto pozor na přepravu reagencií v zimních měsících
- reagencie nesmí být vystaveny vyšším teplotám - dochází k vypažování roztokŕ
dostateľné množství fixažních a barvících roztokŕ a pufr? v kyvetách
kontrola pufru
-makroskopická: pufr - bez viditelných p?ím?sí a změn (vysrážeé soli, plíse?)
-pH

Kontrola po nabarvení nátěru:

Preventivní kontrolu je nutné provádět s každou novou sérií připravených fixažních a barvících roztokŕ a v první barvené sad? skel. Pro tuto kontrolu poučijeme nátěr krve od zdravého jedince, případně od vhodného pacienta. Nátěr hodnotíme makroskopicky a mikroskopicky. Jestli?e jsou barevné reakce ,,správné" (viz dále), potom lze kontrolu kvality akceptovat.

Sledujeme:

1. Makroskopicky:

-krevní nátěry mají být zbarveny purpurov?

- je-li zbarvení nátěru do modra, pufr má vyšší hodnotu pH nebo nátěr je p?ebarvený

- jeli zbarvení do r??ová, pufr má nižší hodnotu pH nebo nátěr je nedobarvený

-odstíny zbarvení nátěrů se mohou v jednotlivých laboratorích li?it

2. Mikroskopicky mají být:

- Erytrocyty r??ovo?edé,

- Trombocyty tmav? r??ové,

- Leukocyty - jádra tmav? fialová

- Eozinofily - granula jasn? oran?ová

- Neutrofily a granulované lymfocyty - granula purpurová

- Bazofolní te?kování erytrocytů má být modré.

3. Zbarvení nátěrů je dáno:

- vlastním barvením a barvícími roztoky,

- typem biologického materiálu (periferní krev, kostní dřeň)

- vlastnostmi biologického materiálu (vysoký či nízký hematokrit, hyperproteinémie, buň?nost).

Jestli?e jsou na nátěrech patrné rozdíly v barvitelnosti buniek (viz výše) ve stejném barvícím cyklu a ve stejné barvící lázni, potom je barvení v po?ádku a změny v obarvení jednotlivých nátěrů jsou dány typem odebraného biologického materiálu (výsledek barvení může být ovlivn?n i buň?ným slo?ením).

Uchování nátěrů

1. nenabarvené, nefixované - vhodné zpracovat do 4 hodin

2. nenabarvené, fixované - je možné uchovávat po neomezenou dobu

3. nabarvené - - je možné uchovávat po neomezenou dobu

Pro uchovávání obarvených nátěrů je nezbytné zbavit nátěr imerzního oleje oplachem nebo ot?rem (?etrný prost?edek je např. ether). Zbytky oleje mohou buňky znehodnotit (dle typu oleje již druhý den). Imerzních olej? je několik druh? a jsou různé kvality. Před použitím je vhodné kvalitu oleje otestovat.

Kontrola zažízení:

1. Pro správné hodnocení nátěrů je potřeba mikroskopy pravidelně ?istit, se?izovat a kontrolovat mechanické a optické části (v zahraniční literatu?e se poučívá pojem kalibrace). Údr?bu mikroskop? je vhodné provádět 1x ročně servisním technikem, ale tento interval je velmi individuální a závisí na frekvenci jeho použití, stá?í a kvality. Pokud mikroskop není tak často poučíván, je nutné zvá?it jiný pravidelný interval.

2. Objektivy je nutné ?istit po každém použití a ?ídit se doporučením firmy.

Dokumentace:

O kontrolách barvení i zažízení je nutné provádět autorizované záznamy (např. provozní deníky, formulá?e).

Literatura:

· Houwen B, Blood Film Praparation and Staining Procedures, Laboratory Hematology 6, 2000, s.1-7.

· Garcia, L. S. Diagnostic Medical Parasitology, ed. 4, ASM Press, Washington, D.C. 2001.

· NCCLS: Laboratory Diagnosis of Blood-Borne Parasitic Diseases. Approved Guideline M15-A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova PA 2000.

· Brown, A. B.: Hematology: principles and procedures, ed. 6, Lea & Fabiger, Philadelphia, London 1993.